Per esaminare lo scopo delle proteine del SARS-CoV-2, l’équipe ha innanzitutto sviluppato una console delle VLP (particelle simil-virali) del virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1) che codificano ciascuna ORF.

Il VSV-G, l’HIV-1 Gag-Pol e un vettore pLVX-StrepII-ORF che trasportava i geni ORF3d, ORF3a, ORF7a, ORF6, ORF7b, ORF8, ORF9c o ORF10 sono stati cotrasfettati in cellule HEK293T per produrre VLP.

Quando i loro titoli sono stati valutati dopo 72 ore, tutte le VLP avevano almeno 104 unità infettive/ml, con la possibile eccezione dell’ORF6 che interpreta una VLP che possiede unità infettive non rilevabili. La Gag, la poliproteina strutturale dell’HIV-1, è stata immunoblottata dai lisati delle cellule HEK293T impiantate per verificare se questo fosse il motivo del declino dell’infettività o della diminuzione della formazione delle particelle.

Per verificare se si verificasse l’effetto dose-dipendente sull’espressione di Gag e sulla sintesi di VLP, gli scienziati hanno poi generato VLP di HIV-1 con GFP (proteina fluorescente verde), aumentando le quantità di ORF6 e forse di ORF9b come controllo. L’HIV-1 Gag con ORF6/ORF9b è stato analizzato mediante immunoblotting in lisati di cellule HEK293T impiantate.

Poiché MLV Gag e la proteina fluorescente mApple hanno complessi proteici completamente diversi dall’HIV-1 Gag, i ricercatori hanno anche esaminato come ORF6 ha influenzato la loro espressione per determinare se la soppressione di ORF6 fosse solo esclusiva dell’espressione di HIV-1 Gag. Analogamente all’HIV-1 Gag, ORF6 ha inibito in modo dose-dipendente la trascrizione di MLV Gag e la produzione di VLP.

Le cellule HEK293T sono state immunoprecipitate con plasmidi che trasportavano GFP e ORF6 con Nup98 e HA-Rae1. Dopo 24 ore, le cellule sono state lisate e GFP o ORF6 sono state immunoprecipitate con un anticorpo anti-Strep.